一、柱壓?jiǎn)栴}
柱壓?jiǎn)栴}是使用液相色譜過程中需要密切注意的地方，柱壓的穩(wěn)定與色譜圖峰形的好壞、柱效、分離效果及保留時(shí)間等密切相關(guān)。所謂柱壓穩(wěn)定并不是指壓力值穩(wěn)定于一個(gè)恒定值而是指壓力波動(dòng)范圍在345kPa 以內(nèi)或在50PSI之間(在使用梯度洗脫時(shí)，柱壓平穩(wěn)緩慢的變化是允許的)。壓力過高、過低都屬于柱壓?jiǎn)栴}。
1.1 壓力過高
這是液相在使用中zui常見的問題，指的是壓力突然升高，
1、一般都是由于流路中有堵塞的原因。此時(shí)，我們應(yīng)該分段進(jìn)行檢查。
(1).首先斷開真空泵的入口處，此時(shí)PEEK管里充滿液體，使PEEK管低于溶劑瓶，看液體是否自由滴下，如果液體不滴或緩慢滴下，則是溶劑過濾頭堵塞。處理方法：用30%的硝酸浸泡半個(gè)小時(shí)，在用超純水沖洗干凈。如果液體自由滴下，溶劑過濾頭正常，在檢查;
(2).打開Purge閥，使流動(dòng)相不經(jīng)過柱子，如果壓力沒有明顯下降，則是過濾白頭堵塞。處理方法：將過濾白頭取出，用10%的異丙醇超聲半個(gè)小時(shí)。如果壓力降至100PSI以下，過濾白頭正常，在檢查;
(3).把色譜柱出口端取下，如果壓力不下降，則是柱子堵塞。處理方法：如果是緩沖鹽堵塞，則用95%的水沖至壓力正常。如果是一些強(qiáng)保留的物質(zhì)導(dǎo)致堵塞，則要用比現(xiàn)在流動(dòng)相更強(qiáng)的流動(dòng)相沖至壓力正常。假如按上面的方法長(zhǎng)時(shí)間沖洗壓力都不下降，則可考慮將柱子的進(jìn)出口反過來接在儀器上，用流動(dòng)相沖洗柱子。這時(shí)，如果柱壓仍不下降，只有換柱子入口篩板，但一旦操作不甚，很容易造成柱效下降，所以盡量少用。問題無法解決可考慮更換色譜柱。
2、流速設(shè)定不正確：可重新設(shè)定正確流量。
3、流動(dòng)相配比不正確：不同配比的流動(dòng)相其黏度系數(shù)不相同，較高黏度的流動(dòng)相相應(yīng)的系統(tǒng)壓力也大，如果可能可更換黏度較小的溶劑或重新設(shè)定配比。
4、系統(tǒng)壓力零點(diǎn)漂移：調(diào)節(jié)壓力傳感器的零點(diǎn)。
1.2 壓力過低
1.一般是由于系統(tǒng)泄漏，處理方法：尋找各個(gè)接口處，特別是色譜柱兩端的接口，把泄漏的地方旋緊即可。拆下柱子加適當(dāng)力擰緊或襯四氟薄膜。
2.泵里進(jìn)了空氣，但此時(shí)表現(xiàn)的往往是壓力不穩(wěn)，忽高忽低，更嚴(yán)重一點(diǎn)會(huì)導(dǎo)致泵無法吸上液體。處理方法：打開Purge閥，用3~5ml/min的流速?zèng)_洗，如果不行，則要用針筒在排空閥處借住外力將氣泡吸出。
3.無流動(dòng)相流出：檢查儲(chǔ)液瓶中有無流動(dòng)相，沉子是否浸在流動(dòng)相中，泵是否運(yùn)行。
4.參比閥未關(guān)閉：將流速降低后關(guān)閉參比閥。一般降至0.1～0.2mL/min后關(guān)閉參比閥。
二、基線問題
2.1基線漂移
基線漂移是色譜工作者普遍遇到的問題,在實(shí)際工作中,我們經(jīng)常能遇到基線漂移的情況,特別是在梯度洗脫的時(shí)候,基線漂移是常有的事。一般說來，機(jī)器剛起動(dòng)時(shí)，基線容易漂移，大概要30min的平衡時(shí)間，如果你用了緩沖溶液或緩沖鹽，還有就是在低波長(zhǎng)下(220nm)平衡時(shí)間相對(duì)會(huì)比較長(zhǎng)，但如果你在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)基線漂移，則你要考慮下面的原因：
1.柱溫波動(dòng) 控制好柱子和流動(dòng)相的溫度，檢查是否有打開的窗戶或空調(diào)對(duì)著柱溫箱。
(即使是很小的溫度變化都會(huì)引起基線的波動(dòng)。通常影響示差檢測(cè)器、電導(dǎo)檢測(cè)器、較低靈敏度的紫外檢測(cè)器或其它光電類檢測(cè)器。)控制好柱子和流動(dòng)相的溫度,在檢測(cè)器之前使用熱交換器。
2.流通池被污染或有氣體 用甲醇或其他強(qiáng)極性溶劑沖洗流通池(斷開柱子)。如有需要，可以用1N的硝酸(不要用鹽酸)。
3.紫外燈能量不足 更換新的紫外燈
4.流動(dòng)相污染、變質(zhì)或由低品質(zhì)溶劑配成。 檢查流動(dòng)相的組成，使用高品質(zhì)的化學(xué)試劑及HPLC級(jí)的溶劑。
2.2基線噪音
對(duì)于紫外檢測(cè)器, 氘燈光源打開后要預(yù)熱30 min以上, 基線才能穩(wěn)定。噪聲是指與被測(cè)物無關(guān)的檢測(cè)器輸出信號(hào)的隨機(jī)擾動(dòng)變化, 分短期噪聲和長(zhǎng)期噪聲兩種。
氘燈用的過久, 接近壽命期時(shí)( 氘燈的壽命約1 000 h) , 會(huì)使基線噪音明顯增加, 應(yīng)及時(shí)更換氘燈。除光源外, 流路中的氣泡也會(huì)產(chǎn)生噪音。對(duì)于判斷基線噪聲增大是由于光源燈的老化還是來自流路中的氣泡的問題, 可將泵關(guān)上, 繼續(xù)走基線, 如果噪聲立即停止, 基線呈一條直線, 說明基線噪聲來自流動(dòng)相中的氣泡, 應(yīng)設(shè)法排氣; 若停泵后仍有噪音出現(xiàn), 應(yīng)考慮是燈的問題。
2.2.1 基線噪音(規(guī)則的)
產(chǎn)生基線噪音的原因有：在流動(dòng)相、檢測(cè)器或泵中有空氣;漏液;流動(dòng)相混合不完全;溫度影響(柱溫過高,檢測(cè)器未加熱);在同一條線上有其他電子設(shè)備;泵振動(dòng)。
了避免基線噪音,在正式進(jìn)樣之前,需要對(duì)流動(dòng)相脫氣;沖洗系統(tǒng)以除去檢測(cè)器或泵中的空氣;檢查管路接頭是否松動(dòng);泵是否漏液;是否有鹽析出和不正常的噪音,如有必要,更換泵密封;用手搖動(dòng)使溶劑混合均勻或使用低粘度的溶劑減少差異或加上熱交換器;有其他電子設(shè)備時(shí)斷開LC、檢測(cè)器和記錄儀,檢查干擾是否來自于外部,加以更正;泵振動(dòng)時(shí)在系統(tǒng)中加入脈沖阻尼器。
2.2.2 基線噪音(不規(guī)則的)
(1) 漏液：檢查接頭是否松動(dòng),泵是否漏液,是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要,更換密封,檢查流通池是否漏液。
(2) 流動(dòng)相污染、變質(zhì)或由低質(zhì)溶劑配成：檢查流動(dòng)相的組成。
(3) 流動(dòng)相各溶劑不相溶：選擇互溶的流動(dòng)相。
(4) 檢測(cè)器/記錄儀電子元件的問題：斷開檢測(cè)器和記錄儀的電源,檢查并更正。
(5) 系統(tǒng)內(nèi)有氣泡：用強(qiáng)極性溶液清洗系統(tǒng);檢測(cè)器內(nèi)有氣泡,清洗檢測(cè)器,在檢測(cè)器后面安裝背景壓力調(diào)節(jié)器。
(6) 流通池污染(即使是極少的污染物也會(huì)產(chǎn)生噪音) :用硝酸清洗流通池;
(7) 檢測(cè)器燈能量時(shí)不足更換燈;
(8) 色譜柱填料流失或阻塞:更換色譜柱。
(9) 流動(dòng)相混合不均勻或混合器工作不正常:維修或更換混合器,在流動(dòng)相不走梯度時(shí),不建議使用泵的混合裝置。
三、保留時(shí)間
3.1保留時(shí)間漂移
保留時(shí)間的漂移往往由柱老化引起,而柱老化不可能引起保留時(shí)間的無規(guī)律波動(dòng)。事實(shí)上,保留時(shí)間漂移的多半原因是由于不同機(jī)理的色譜柱老化,如固定相流失(例如通過水解) ,色譜柱污染(由樣品或流動(dòng)相所致)等。保留時(shí)間漂移的幾種zui常見的原因和解決方法如下：
(1) 色譜柱平衡
如果觀察到保留時(shí)間漂移,首先應(yīng)考慮色譜柱是否已經(jīng)平衡。在每一次運(yùn)行之前給予足夠的
時(shí)間平衡色譜柱。通常平衡需要10～20個(gè)柱體積的流動(dòng)相,但如果在流動(dòng)相中加入少量添加劑
(如離子對(duì)試劑)則需要相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間來平衡色譜柱。流動(dòng)相污染也可能是原因之一。溶于流動(dòng)
相中的少量污染物可能慢慢富集到色譜柱上,從而造成保留時(shí)間的漂移。應(yīng)注意:水是很容易污染的流動(dòng)相成分。
(2) 固定相穩(wěn)定性
固定相的穩(wěn)定性都是有限的,即使在推薦的pH范圍內(nèi)使用,固定相也會(huì)慢慢水解。例如,硅膠基質(zhì)在pH4時(shí)水解穩(wěn)定性,水解速度與流動(dòng)相類型和配體有關(guān)。雙官能團(tuán)配體和三官能團(tuán)配體比單官能團(tuán)配體的鍵合相要穩(wěn)定;長(zhǎng)鏈鍵合相比短鏈鍵合相穩(wěn)定;烷基鍵合相比氰基鍵合相穩(wěn)定的多。經(jīng)常清洗色譜柱亦會(huì)加速色譜柱固定相的水解。其他硅膠基質(zhì)鍵合相在水溶液環(huán)境中也可以發(fā)生水解,如氨基鍵合相等。
(3) 色譜柱污染
保留時(shí)間漂移的另一個(gè)常見原因是色譜柱污染。HPLC色譜柱是非常有效的吸附性過濾器,它可以過濾并吸附流動(dòng)相攜帶的任何物質(zhì)。污染源可以是:流動(dòng)相本身,流動(dòng)相容器,連接管、泵、進(jìn)樣器和儀器密封墊,以及樣品等。通常通過實(shí)驗(yàn)可判斷污染的來源。樣品中如果存在色譜柱上保留很強(qiáng)的組分,就可能是使保留時(shí)間漂移的潛在根源。這些根源通常是樣品基質(zhì),如:配藥中的賦形劑,生化樣品(如血清)中的蛋白及類脂類化合物,食品樣品中的淀粉,環(huán)境水樣中的腐殖酸等。通常樣品中的強(qiáng)保留組分具有較高的分子量,在此情況下,保留時(shí)間漂移的同時(shí)或其后會(huì)有反壓的增加,可以通過使用固相提取( SPE)等樣品前處理方法來去除樣品基質(zhì)的影響,避免色譜柱污染zui簡(jiǎn)單的方法是防患于未然。相比之下,找到問題的所在并設(shè)計(jì)有效的清洗步驟以去除污染物要困難的多。通常使用在給定色譜條件下的強(qiáng)溶劑,但并非所有污染物都可以在流動(dòng)相中溶解。如THF可去除反相色譜柱中的許多污染物,但蛋白在THF中就不能溶解, DMSO常常用于去除反相色譜柱中的蛋白。使用保護(hù)柱是個(gè)非常有效的方法。反沖色譜柱僅是不得已時(shí)采用的辦法。
(4) 流動(dòng)相組成
流動(dòng)相組成的緩慢變化也是保留時(shí)間漂移的常見原因。如流動(dòng)相中易揮發(fā)組分的揮發(fā)及循環(huán)使用流動(dòng)相等,應(yīng)防止流動(dòng)相由于蒸發(fā)、反應(yīng)等等原因造成的變化。
保留時(shí)間重現(xiàn)是液相性能好壞的一個(gè)重要標(biāo)志，同一種東西，兩次的保留時(shí)間相差不要超過15s，超過了半分鐘可看做保留時(shí)間漂移，就無法進(jìn)行定性。
四、峰型異常問題
峰型問題是液相的主要問題，在做液相過程中，我們就是要變換不同的條件來改善不好的峰型，對(duì)于各種各樣的異常峰，要區(qū)別對(duì)待，從主要問題出發(fā)，一個(gè)一個(gè)加以解決
1.色譜圖中未出峰 系統(tǒng)未進(jìn)樣或樣品分解;泵未輸液或流動(dòng)相使用不正確;檢測(cè)器設(shè)置不正確;針對(duì)以上情況成因作相應(yīng)調(diào)整即可。
2. 一個(gè)峰或幾個(gè)峰是負(fù)峰 流動(dòng)相吸收本底高;進(jìn)樣過程中進(jìn)入空氣;樣品組分的吸收低于流動(dòng)相。
3.所有峰均為負(fù)峰 信號(hào)電纜接反或檢測(cè)器輸出極性設(shè)置顛倒;光學(xué)裝置尚未達(dá)到平衡。
4.所有峰均為寬峰 系統(tǒng)未達(dá)到平衡;溶解樣品的溶劑極性比流動(dòng)相差很多;色譜柱尺寸及類型選擇不正確;色譜柱或保護(hù)柱被污染或柱效降低;溫度變化造成的影響。 、
5.所出峰比預(yù)想的小 樣品黏度過大;進(jìn)樣品故障或進(jìn)樣體積誤差;檢測(cè)器設(shè)置不正確.定量環(huán)體積不正確;檢測(cè)池污染;檢測(cè)器燈出現(xiàn)問題。
6.出現(xiàn)雙峰或肩峰 進(jìn)樣量過大;樣品濃度過高;保護(hù)柱或色譜柱柱頭堵塞;保護(hù)拄或色譜柱污染或失效;柱塌陷或形成短通道。
7.前伸峰：進(jìn)樣量或樣品濃度高，溶解樣品的溶劑較流動(dòng)相極性強(qiáng);保護(hù)柱或色譜柱污染或失效。
①柱溫低：升高柱溫;②樣品溶劑選擇不恰當(dāng)：使用流動(dòng)相作為樣品溶劑;③樣品過載：降低樣品含量;④色譜柱損壞：更換柱子。
8.拖尾峰：柱超載，降低樣品量;增加柱直徑采用較高容量的固定相;峰干擾，對(duì)樣品進(jìn)行清潔過濾;調(diào)整流動(dòng)相;硅羥基作用，加入三乙胺，用堿致鈍化柱增加緩沖液或鹽的濃度降低流動(dòng)相pH值;柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效，更換燒結(jié)不銹鋼;加在線過濾器，對(duì)樣品進(jìn)行過濾;死體積或柱外體積過大，將連接點(diǎn)降至zui低;盡可能使用內(nèi)徑較細(xì)的連接管;柱效下降，更換柱子;采用保護(hù)柱，對(duì)柱子進(jìn)行再生。
9.出現(xiàn)平頭峰 檢測(cè)器設(shè)置不正確;進(jìn)樣體積太大或樣品濃度太高。
10.出現(xiàn)鬼峰 進(jìn)樣閥殘余峰，可能為上次樣品的殘余。在每次進(jìn)完樣后用充足的時(shí)間來平衡和清洗系統(tǒng);樣品中存在未知物，改進(jìn)樣品的預(yù)處理;流動(dòng)相污染，更換新流動(dòng)相，盡可能現(xiàn)配現(xiàn)用，隔夜的流動(dòng)相再次使用時(shí)要過濾;盡可能使用HPLC級(jí)試劑;流路中有小的氣泡，打開Purge閥，加大流速排除。
11.峰分叉 ①保護(hù)柱或分析柱污染：取下保護(hù)柱再進(jìn)行分析,如果必要更換保護(hù)柱。如果分析柱阻塞,拆下來清洗。如果問題仍然存在,可能是柱子被強(qiáng)保留物質(zhì)污染,運(yùn)用適當(dāng)?shù)脑偕胧Ｈ绻麊栴}仍然存在,入口可能被阻塞,更換篩板或更換色譜柱。②樣品溶劑不溶于流動(dòng)相改變樣品溶劑,如果可能采取流動(dòng)相作為樣品溶劑。
12.峰變形 樣品過載，減少樣品載量。
13.早出的峰變形 樣品溶劑選擇不恰當(dāng) ①減少進(jìn)樣體積 ②運(yùn)用低極性樣品溶劑
14.早出的峰拖尾程度大于晚出的峰 柱外效應(yīng) ①調(diào)整系統(tǒng)連接(使用更短、內(nèi)徑更小的管路)
②使用小體積的流通池
15.酸性或堿性化合物的峰拖尾 緩沖不合適①使用濃度50～100 mM的緩沖液②使用Pka等于流動(dòng)相pH值的緩沖液
16.額外的峰 (1)樣品中有其他組分：正常現(xiàn)象;(2)、前一次進(jìn)樣的洗脫峰：①增加運(yùn)行時(shí)間或梯度斜率②提高流速;(3)空位或鬼峰：①檢查流動(dòng)相是否純凈 ②使用流動(dòng)相作為樣品溶劑 ③減少進(jìn)樣體積。
小結(jié)
以上內(nèi)容只是對(duì)液相色譜中出現(xiàn)的常見的問題進(jìn)行了分析，當(dāng)然在我們實(shí)際應(yīng)用當(dāng)中還會(huì)遇到更多的其它問題，在故障排除時(shí)要遵守以下原則：一次只改變一個(gè)因素，確定假定因素與問題之間的;如果通過更換組件來排查故障時(shí)要注意將拆下的完好組件裝回原位，避免浪費(fèi);養(yǎng)成良好的記錄習(xí)慣，這是成功進(jìn)行故障排除的關(guān)鍵?？傊谑褂靡合嗌V時(shí)一定要注意樣品的前處理與儀器的正確操作和保養(yǎng)。
