談談使用前準備
1、使用前認真閱讀色譜柱的說明書，了解色譜柱的種類，選用合適的色譜柱。
在選用色譜柱時，應充分考慮所分析樣品的極性大小、化合物的種類數(shù)量、結構特征。根據(jù)化合物的性質，選擇合適的色譜柱和分析條件。
不同類型的色譜柱使用的流動相不同，使用錯誤的流動相會降低柱效，損傷柱子。如分析極性較大的多糖類成分，應當采用親水性的反相填料。對于首次使用的色譜柱，還應按照廠家的出廠說明對色譜柱進行低流速的沖洗活化，活化后的色譜填料共價鍵鍵合力增強，柱效提高，壽命延長。
2、樣品的準備與預處理
我們的經(jīng)驗是樣品純化得越干凈，色譜柱的使用壽命越長。許多樣品，尤其是生物樣品，組份非常復雜，對色譜柱的損傷性較大，不經(jīng)預處理的樣品直接分析，會嚴重縮短色譜柱的使用壽命。因此，在樣品的準備時需對樣品進行預處理，包括準備溶劑的選擇、樣品過濾等。
（1）制樣溶劑的選擇
制樣溶劑通常需要考慮樣品的溶解性、與流動相的相溶性、色譜填料的適用性等方面。這類溶劑需對樣品有較大的溶解性，而且與流動相溶，洗脫強度最好低于流動相或梯度洗脫中的起始流動相，以免影響樣品分離。
目前許多手性色譜柱都禁止使用DMSO、四氫呋喃、氯仿等溶解樣品，這些溶劑會破壞固定相的結構，從而縮短色譜柱的使用壽命。此外，制樣溶劑還應與色譜系統(tǒng)其他部件如高壓泵、進樣器等相適用。
（2）制樣溶劑過濾
在進樣前需過濾樣品溶液，如采用0.22μm的微孔濾膜除去不溶性微粒，以免堵塞柱頭濾片及柱內(nèi)填充床。在條件允許的情況下，最好采用與色譜柱同種填料的固相萃取柱過濾進樣溶液，可以減少在色譜柱上死吸附的物質或易堵塞的大分子樣品。
如生物樣品中的小極性的油脂類易于沉淀死吸附在C18反相色譜柱中，導致柱效降低、柱壓升高。采用SPE柱過濾后，可以有效減少在色譜柱中附著沉積的死吸附成分，保護色譜柱不被污染，保證其使用壽命。
（3）其他，如溶液濃度、進樣量等
分析物的某些性質同樣能影響色譜柱的使用壽命。強酸、強堿性物質和蛋白質類生物大分子，它們能與固定相填料作用，或生成不可逆吸附層，改變填料表面特征，使色譜柱性能發(fā)生變化，最終導致分離失效。此外樣品的進樣量過大、超載都會影響色譜柱的分離性能和使用壽命。
使用過程中的維護
1、流動相的使用和分析方法的選擇
流動相的純度、溶劑的選擇、適當分析方法的使用與色譜柱的性能和壽命密切相關。
（1）流動相的選擇
所選用的流動相應與色譜柱、待分析樣品相兼容，即樣品、樣品溶液和流動相是互溶的。流動相能夠溶解樣品，避免樣品沉淀析出；同時還要求流動相與樣品不發(fā)生化學反應，并且要求與色譜柱不能發(fā)生溶解或化學反應。
色譜分析應選擇色譜級的流動相。通常分析純的溶劑含有微量雜質，如有機溶劑中的聚乙二醇、無機鐵離子（Fe+）等，作為流動相大量使用后會引起色譜柱性能變化。最好是使用色譜純級或者更高純度的試劑，盡量降低溶劑中雜質帶來的損傷。
（2）流動相過濾
使用色譜純試劑配制流動相，使用前需經(jīng)0.45μm或者更小孔徑的濾膜過濾和超聲脫氣處理，減少灰塵、微生物等雜質堵塞色譜柱，尤其是水溶性流動相易引起微生物生長而造成色譜柱阻塞。流動相最好是現(xiàn)配現(xiàn)用，放置時間最好不要超過2天。
（3）流動相的pH和緩沖鹽的選擇
極端pH的流動相會破壞填料內(nèi)的共價鍵，“溶解”硅膠，使固定相流失，從而降低柱效，縮短使用壽命。以硅膠作基質的固定相一般要求pH在2.5~7范圍內(nèi)使用。
長期在pH>7或pH<2使用環(huán)境中，硅膠會逐漸溶解或者表面鍵合的官能團會逐漸流失。如果一定要用高或低pH的流動相，最好是選用相適應的色譜填料。
（4）流速的控制
目前粒徑為1.8μm的UPLC的流速常設為0.3~0.5mL/min，粒徑為5μm的HPLC分析流速不大于1.5mL/min，粒徑為10μm半制備柱流速控制在3mL/min。流速過大，壓力升高，會引起色譜填料沖垮、塌陷。
2、色譜儀器的操作
每次開機使用分析儀器時，泵啟動太快，流速和柱壓的瞬間升高，柱床受到?jīng)_擊，引起紊亂，產(chǎn)生空隙，影響色譜柱的使用壽命。因此，在操作實驗開始時，應當將流速和柱壓逐漸增加。
3、保護柱的使用
“保護柱”是與所使用液相色譜柱相同填料的短型色譜柱，可以有效地阻攔容易損壞色譜柱的大分子和不溶性顆粒，過濾易沉著色譜柱上產(chǎn)生死吸附的物質，從而延長色譜柱使用壽命。
4、柱溫的控制
不同類型的色譜柱耐受的溫度各有差別。通常色譜柱溫維持在10～40℃之間，能夠充分、最優(yōu)的發(fā)揮色譜柱的性能。超出色譜柱溫度范圍，尤其高于柱溫范圍，會增加對流動相中化學物質的吸附，引起色譜柱固定相結構的改變；此外，還可能引起柱床塌陷，改變峰形，降低柱效，產(chǎn)生不可逆性的損傷。
使用后的清洗與保存
柱子使用一段時間后，總會有一些雜質累積在柱內(nèi)，保留值較弱的物質，一般能快速從色譜柱沖洗出來，不產(chǎn)生干擾；中等保留強度的雜質能被緩慢沖洗出來，但對分析產(chǎn)生一定的干擾；強保留雜質通常聚集在柱頭或色譜柱中，難以被洗脫，甚至可能與填料發(fā)生相互作用，形成新的偽固定相，改變色譜柱的分離性能。通常表現(xiàn)為柱壓升高、基線不平、色譜雙峰、分離性能降低等。
這些被污染的色譜柱經(jīng)清洗后，可恢復部分甚至大部分離能力。因此使用后認真、定期清洗，不僅能延長色譜柱的使用壽命，節(jié)省資源，還能大大降低分析的成本。以我們常用的硅膠基質色譜柱為例，簡要闡述常用色譜柱的清洗與再生。
1、色譜柱的清洗與再生
色譜柱的使用前后都需經(jīng)較強的流動相沖洗。通常情況下，在使用硅膠、氧化鋁、極性鍵合相色譜柱時，每次用完后可先用二氯甲烷或正己烷等溶劑低流速長時間的沖洗；鍵合反相硅膠色譜柱、離子交換色譜柱和凝膠色譜柱可先用高比例的水（甲醇水混合溶劑）沖洗，再用100%甲醇沖洗。
此外，色譜柱低流速的反相沖洗能夠有效除去堵塞在柱頭或篩板上的雜質，以及清洗聚集在柱頭部位的較強吸附物質。有些色譜柱在許多方法處理污染失效后，反過來使用，不僅柱壓降變小，柱效也可恢復如，延長了色譜柱的使用時間。
若上述常規(guī)清洗法無法清除污染物，則有必要采用更強的洗脫劑清洗，如反相材料的沖洗順序為：100%甲醇→100%乙腈→乙腈∶異丙醇(75∶25，V/V)→100%異丙醇?；蛘呖梢圆捎幂^低濃度的稀酸或稀堿可將有機溶劑不能洗脫的污染物除去。
例如采用0.05mol/L的硫酸和流動相溶液沖洗色譜柱，可取得良好效果；或者采用1%氫氧化銨或50%二甲基甲酰胺水溶液，對聚集在柱頭的污染物具有良好的清洗效果。
如果分析時流動相中含有緩沖液（通常為鹽溶液），沖洗時宜用水取代緩沖液與有機相混合沖洗色譜柱（20倍柱體積）；再用100%有機溶劑沖洗。若直接用100%有機溶劑沖洗，可造成緩沖液沉積析出，從而損壞柱子品質。
同樣的，若流動相中加入酸、堿溶液時，也應當按照上述方法，先采用高比例的水（水：甲醇10:90）沖洗20倍柱體積，防止強酸強堿溶液導致硅膠基質填料的溶解。
蛋白質對反相色譜柱的污染已成為常見問題，尤其在分離未經(jīng)處理的動物組織等生物樣品。一般情況下，純有機溶劑如乙腈或甲醇不能很有效地清洗色譜柱，因而需要一些特殊的清洗方法。
首先嘗試用高比例強極性溶劑的流動相進行沖洗，如乙腈∶異丙醇（1:2,V/V）；或使用0.1%的三氟乙酸水溶液或者0.1%乙酸水溶液清洗。此外，還可以采用1%十二烷基硫酸鈉 (SDS)，然后用5%～95%乙腈/水（含0.1%TFA）梯度沖洗，去除蛋白污染物效果也較好。
若采用上述的條件清洗后色譜柱仍不能達到理想的效果，有必要將固定相從色譜柱內(nèi)取出，進行清洗再生后重新裝填。
具體操作是：將色譜固定相從色譜柱內(nèi)打出后，用甲醇浮選，去除其中細小的破碎顆粒；然后用二甲基甲酰胺、丙酮、甲醇超聲清洗；最后干燥固定相，重新裝填色譜柱。經(jīng)該方法處理的色譜柱，性能可得到顯著提高。
2、色譜柱的保存
色譜柱的保存應按照使用說明書中所指明的溶劑進行填充，盡可能的貯存于100%有機溶劑。色譜柱不能貯存在水或含水量高的溶劑中，會引起微生物的滋生，影響色譜柱壽命。如反相色譜柱長期不用，蕞好采用90%~95%的有機溶劑混合水溶液保存，防止色譜柱因密封不嚴造成色譜柱兩頭干涸、斷層引起的壽命縮短。
此外，色譜柱還應當輕拿輕放，避免劇烈碰撞引起的色譜柱填料產(chǎn)生塌陷、斷層，縮短使用壽命。
